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    細(xì)胞凍存方法

    發(fā)布時(shí)間: 2009-08-05  點(diǎn)擊次數(shù): 6000次

    細(xì)胞凍存的一般方法 
     
    開始細(xì)胞凍存前,仔細(xì)檢查細(xì)胞凍存所需的儀器和試劑是否齊全:一般主要有:傳代細(xì)胞單層、適宜生長(zhǎng)液、滅活小牛血清、慶大霉素溶液、7.5%NaHC03溶液、0.25%胰蛋白酶溶液、標(biāo)簽用具:100ml方瓶(培養(yǎng)細(xì)胞用)、克氏瓶、紅翻帽塞、吸管(10ml、lml)、細(xì)胞凍存管、二甲基亞砜、CO2孵箱、超掙臺(tái)、倒置顯微鏡、2~8℃冰箱、-20℃冰箱、液氮罐

    操作步驟

    鏡檢細(xì)胞,挑選培養(yǎng)3~4天的細(xì)胞,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)污染、異常及可疑病變細(xì)胞。配制細(xì)胞培養(yǎng)液:根據(jù)不同的細(xì)胞需用不同的基礎(chǔ)液,培養(yǎng)液配方為(基礎(chǔ)液:7.5%碳酸氫鈉:1萬(wàn)單位慶大霉素=100:1:0.25)。制備細(xì)胞懸液:挑選培養(yǎng)3—4天的細(xì)胞,細(xì)胞界限清晰,具有立體感,細(xì)胞形態(tài)良好的單層細(xì)胞瓶,棄去培養(yǎng)液,先用PBS洗液沖洗細(xì)胞表面1-2次,再向克氏瓶中加入0.25%胰酶8ml,等細(xì)胞面開始出現(xiàn)裂縫時(shí)倒掉瓶中部分胰酶,大克氏瓶中保留2 ml,放置幾分鐘使細(xì)胞*脫落到胰酶中,收集含細(xì)胞的胰酶,并用培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞瓶3-4次,收集沖洗液;向收集液中補(bǔ)加以下物質(zhì):小牛血清使終濃度為20%、二甲基亞砜使終濃度為9%;分裝:將細(xì)胞懸液混勻后,立即分裝于細(xì)胞凍存管中,每管按1~1.6ml的量分裝,擰緊管蓋;在凍存管上做好標(biāo)記,包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期等。

    凍存

    先將凍存管放入普通冰箱冷藏室(2~8℃),約3-4h;接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室,約3-4 h;然后將凍存管放置液氮灌口,過(guò)夜;zui后將凍存管投入液氮保存。記錄:記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過(guò)程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。




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