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    研域干貨:培養(yǎng)細(xì)胞樣品怎么處理?

    發(fā)布時(shí)間: 2019-11-14  點(diǎn)擊次數(shù): 1550次

    樣本處理的方法:


    1. 融解RIPA裂解液,混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加PMSF,使PMSF的終濃度為1mM。


    2. 關(guān)于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(假如血清中的蛋白沒有干擾,能夠不洗)。依照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充沛觸摸。一般裂解液觸摸細(xì)胞1-2秒后,細(xì)胞就會(huì)被裂解。

     

    3. 充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。


    關(guān)于安排樣品:


    1. 把安排剪切成細(xì)微的碎片。


    2. 融解RIPA裂解液,混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加PMSF,使PMSF的*終濃度為1mM。


    3. 依照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。(假如裂解不充沛能夠恰當(dāng)添加更多的裂解液,假如需求高濃度的蛋白樣品,能夠恰當(dāng)減少裂解液的用量。)


    4. 用玻璃勻漿器勻漿,直至充沛裂解。

     

    5. 充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。


    6. 假如安排樣品自身非常細(xì)微,能夠恰當(dāng)剪切后直接參加裂解液裂解,經(jīng)過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充沛。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)試驗(yàn)。直接裂解的長處是比較方便,不用運(yùn)用勻漿器,缺陷是不如運(yùn)用勻漿器那樣裂解得比較充沛。

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